在培養(yǎng)箱內(nèi)通過時間序列熒光顯微觀察活細胞增殖過程，核心是在維持細胞生理活性的前提下，通過 “特異性熒光標記 + 自動化長時程成像 + 定量分析"，動態(tài)捕捉細胞從 G1 期到分裂為兩個子細胞的完整周期，同時避免環(huán)境波動（溫度、CO?）和光毒性對增殖的干擾。以下從技術體系構建、實驗操作流程、數(shù)據(jù)定量方法及關鍵注意事項展開，提供可落地的研究方案：

一、核心技術體系：適配 “培養(yǎng)箱內(nèi)" 與 “活細胞增殖" 的特殊需求

細胞增殖是連續(xù)的動態(tài)過程（如 HeLa 細胞周期約 24 小時），且對環(huán)境敏感（溫度波動 ±1℃即可影響周期進程），需針對性解決 “環(huán)境穩(wěn)定性"“標記特異性"“成像低損傷" 三大核心問題，技術選型如下：

技術模塊核心需求推薦方案關鍵優(yōu)勢

培養(yǎng)箱內(nèi)成像系統(tǒng)1. 嵌入培養(yǎng)箱，維持 37℃、5% CO?、高濕度；

2. 自動化定時成像，減少人為干擾；

3. 兼容熒光與明場，滿足增殖觀察1. 專用培養(yǎng)箱內(nèi)成像儀：如 Incucyte SX5、JuLI Br；

2. 定制化顯微鏡 + 培養(yǎng)艙：普通倒置熒光顯微鏡搭配恒溫 / 恒 CO?密閉艙（如 Tokai Hit 培養(yǎng)艙）1. 無環(huán)境波動，細胞增殖狀態(tài)更接近生理水平；

2. 支持 72-120 小時連續(xù)成像，覆蓋多代細胞增殖；

3. 低振動設計，避免成像漂移

細胞增殖熒光標記1. 標記細胞核（區(qū)分單個細胞，計數(shù)增殖數(shù)量）；

2. 無毒性 / 低毒性，不影響細胞周期；

3. 熒光穩(wěn)定，適配長時程觀察1. 活細胞細胞核探針：Hoechst 33342（激發(fā) 350nm，發(fā)射 461nm，低毒性，2-5μg/mL 濃度可維持 48 小時）、SiR-DNA（遠紅外熒光，激發(fā) 652nm，發(fā)射 674nm，光毒性極低，適合 72 小時以上觀察）；

2. 增殖特異性熒光蛋白：基因編輯細胞（如 Ki67-GFP，Ki67 僅在增殖細胞中表達，可區(qū)分增殖 / 靜息細胞）1. 細胞核標記清晰，便于計數(shù)分裂細胞；

2. 遠紅外熒光（如 SiR-DNA）可減少光毒性，適合長期追蹤；

3. 增殖特異性標記（Ki67-GFP）可直接篩選增殖細胞群體

長時程成像參數(shù)1. 低光劑量，避免光毒性導致增殖停滯；

2. 合適時間間隔，完整捕捉分裂過程；

3. 足夠視野數(shù)量，保證統(tǒng)計可靠性1. 激發(fā)光強度：熒光通道≤20%（如 Hoechst 通道激發(fā)光強度 10%-15%）；

2. 曝光時間：熒光通道 50-200ms，明場通道 10-50ms；

3. 時間間隔：15-30 分鐘 / 次（短于細胞分裂時長，避免漏拍分裂過程）；

4. 視野數(shù)量：96 孔板每孔拍 3-5 個視野，覆蓋不同細胞密度區(qū)域1. 光毒性降至低，細胞增殖率與常規(guī)培養(yǎng)無差異；

2. 每 24 小時可獲取 48-96 張圖像，完整記錄細胞從間期到分裂的動態(tài)；

3. 多視野數(shù)據(jù)減少抽樣誤差，統(tǒng)計結果更可靠

二、實驗操作流程：從細胞準備到成像啟動的完整步驟

以 “96 孔板培養(yǎng) HeLa 細胞，用 Hoechst 33342 標記，培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù) 72 小時觀察增殖" 為例，詳細流程如下：

1. 細胞準備：確保初始狀態(tài)一致，減少實驗問題

細胞接種：

選擇對數(shù)生長期的 HeLa 細胞（增殖活性穩(wěn)定），用胰酶消化后制成單細胞懸液，計數(shù)調整濃度至5×103-1×10? cells / 孔（96 孔板，每孔加 100μL 培養(yǎng)基）；

接種后將 96 孔板放入 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱，靜置 24 小時（讓細胞貼壁并恢復活性，避免初始狀態(tài)波動影響增殖）。

熒光標記：

配制2×Hoechst 33342 工作液（用培養(yǎng)基稀釋，終濃度 2μg/mL，避免濃度過高導致細胞毒性）；

每孔吸棄 50μL 舊培養(yǎng)基，加入 50μL 2× 工作液，輕輕吹打混勻，放回培養(yǎng)箱孵育 30 分鐘（確保細胞核充分染色）；

孵育后無需洗去多余探針（Hoechst 33342 可在細胞內(nèi)維持 48-72 小時，且低濃度下無明顯毒性），直接轉移至培養(yǎng)箱內(nèi)成像系統(tǒng)。

2. 成像系統(tǒng)設置：平衡成像質量與細胞保護

以 Incucyte SX5 為例，參數(shù)設置需圍繞 “低光損傷" 和 “動態(tài)捕捉" 優(yōu)化：

通道選擇：同時開啟 “明場"（觀察細胞形態(tài)，輔助判斷細胞活性）和 “藍色熒光通道"（Hoechst 33342，標記細胞核）；

成像參數(shù)：

明場：曝光時間 15ms，增益 1.0（避免強光照射）；

藍色熒光：激發(fā)光強度 12%，曝光時間 100ms，增益 1.2（信號清晰且光劑量低）；

時間序列設置：

時間間隔：20 分鐘 / 次（HeLa 細胞分裂約 18-24 小時，20 分鐘間隔可完整記錄分裂的 “核膜消失→染色體分離→核膜重建" 過程）；

總時長：72 小時（覆蓋 3 代細胞增殖，觀察增殖速率變化）；

視野選擇：每孔選擇 4 個視野（孔的中心 + 四周各 1 個，避免邊緣效應導致的細胞密度不均），確保每個視野初始細胞數(shù)約 20-30 個（便于統(tǒng)計增殖倍數(shù)）。

3. 成像啟動與實時監(jiān)控：及時排除異常

啟動成像后，前 3 個循環(huán)（1 小時內(nèi)）需實時查看圖像：

明場圖像：細胞貼壁良好，無皺縮、漂?。ㄅ懦臃N或標記導致的細胞損傷）；

熒光圖像：細胞核染色均勻，無明顯背景噪音（若背景高，可適當降低增益或更換新鮮培養(yǎng)基）；

若發(fā)現(xiàn)部分視野細胞密度過高（可能導致后期重疊，影響計數(shù)），可補充設置低細胞密度孔的成像（如初始接種 3×103 cells / 孔）；

成像過程中無需打開培養(yǎng)箱（系統(tǒng)自動完成），避免環(huán)境波動影響增殖。

三、數(shù)據(jù)定量分析：從圖像到增殖指標的轉化

72 小時成像會生成大量時間序列圖像（如 96 孔板 ×4 視野 ×216 次循環(huán) = 82944 張圖像），需通過 “圖像預處理→細胞計數(shù)→增殖參數(shù)計算" 三步解析，常用工具包括Incucyte Analysis Software（自帶）、ImageJ（Fiji）（開源，需安裝 “Cell Counter" 插件）。

1. 圖像預處理：消除干擾，統(tǒng)一數(shù)據(jù)標準

背景扣除：針對熒光通道，用 “滾動球背景扣除"（Fiji：Process→Subtract Background，滾動球半徑 50 像素）去除培養(yǎng)皿背景熒光，確保僅細胞核信號被計數(shù)；

去噪：用 “高斯濾波"（Fiji：Process→Filters→Gaussian Blur，sigma=1.0 像素）消除隨機噪音，避免誤判為細胞；

閾值分割：熒光通道設置固定閾值（如基于初始時間點的陰性對照孔，確定 “細胞核信號 - 背景" 的分界值），將細胞核轉化為黑白二值圖像（便于自動計數(shù)）。

2. 核心增殖指標計算：量化增殖效率與動態(tài)

通過計數(shù)不同時間點的細胞核數(shù)量，結合時間維度，提取關鍵增殖指標，反映細胞增殖的動態(tài)規(guī)律：

增殖指標定義計算方法生物學意義

細胞總數(shù)增長曲線不同時間點的總細胞數(shù)隨時間變化每個時間點（如 0h、24h、48h、72h）統(tǒng)計所有視野的細胞核總數(shù)，繪制 “細胞數(shù) - 時間" 曲線直觀反映增殖趨勢（如對數(shù)期、平臺期的出現(xiàn)時間）

增殖倍數(shù)某時間點細胞數(shù)與初始時間點的比值增殖倍數(shù) =（t 時刻細胞數(shù)）/（0h 時刻細胞數(shù)）量化整體增殖效率（如 72h 增殖倍數(shù) = 5.0，代表 5 倍增長）

群體倍增時間（PDT）細胞總數(shù)翻倍所需的時間基于對數(shù)期數(shù)據(jù)（如 24h-48h），用公式：PDT = (t2 - t1) × log2 / (logN2 - logN1)（N1=t1 時刻細胞數(shù)，N2=t2 時刻細胞數(shù)）比較不同組（如對照組 vs 藥物處理組）的增殖速率（PDT 越短，增殖越快）

分裂率單位時間內(nèi)發(fā)生分裂的細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比例手動或自動追蹤細胞核分裂事件（如 1 個細胞核分裂為 2 個），分裂率 =（分裂細胞數(shù)）/（總細胞數(shù)）×100%反映細胞進入分裂期的比例（如分裂率下降，提示增殖受抑制）

細胞周期時長單個細胞從一次分裂結束到下一次分裂結束的時間用 “細胞追蹤" 功能（如 Incucyte 的 “Cell Tracking" 模塊）標記單個細胞，記錄其兩次分裂的時間差，統(tǒng)計多個細胞的平均值分析單個細胞層面的周期異質性（如部分細胞周期延長，可能提示應激）

3. 結果可視化：清晰呈現(xiàn)增殖動態(tài)

增長曲線：用 GraphPad Prism 繪制 “細胞總數(shù) - 時間" 折線圖（帶誤差線，每組 3 個復孔），標注對數(shù)期、平臺期的區(qū)間；

分裂動態(tài)視頻：將單個視野的時間序列圖像合成為視頻（Fiji：Image→Stacks→Make Movie），直觀展示細胞從單個分裂為多個的過程（如細胞核先變大、再分裂為兩個）；

熱圖：用 Excel 或 Origin 繪制 “不同時間點 - 不同孔的增殖倍數(shù)熱圖"，快速對比多組（如不同藥物濃度）的增殖差異。

四、關鍵注意事項：避免實驗誤差與細胞損傷

熒光標記的毒性控制：

Hoechst 33342 終濃度需≤5μg/mL（濃度過高會抑制 DNA 復制，導致增殖停滯），且成像時藍色激發(fā)光強度≤15%（避免光毒性疊加）；

若需觀察超過 72 小時，優(yōu)先選擇 SiR-DNA（遠紅外熒光，光毒性遠低于 Hoechst），或采用 “脈沖標記"（如每天孵育 30 分鐘后洗去，減少探針積累）。

環(huán)境穩(wěn)定性維護：

培養(yǎng)箱內(nèi)成像系統(tǒng)需定期校準溫度和 CO?濃度，避免因環(huán)境波動導致增殖速率異常；

96 孔板需用封口膜密封（僅留透氣孔），防止培養(yǎng)基蒸發(fā)導致滲透壓升高（尤其 72 小時以上成像）。

數(shù)據(jù)可靠性驗證：

每組實驗至少 3 個生物學重復（不同批次細胞），每個重復 3 個技術重復（同批次不同孔），避免單次實驗誤差；

計數(shù)時需排除 “細胞重疊" 干擾（如用 ImageJ 的 “Watershed" 功能分割重疊細胞核），或選擇初始細胞密度較低的視野（避免后期重疊）。

細胞活性監(jiān)控：

結合明場圖像判斷細胞活性（若細胞皺縮、變圓，即使細胞核存在，也需排除在增殖計數(shù)外）；

可額外添加 “活細胞熒光探針"（如 Calcein-AM，綠色熒光標記活細胞），同時監(jiān)控活性與增殖，確保計數(shù)的是活細胞。

五、典型應用場景

藥物增殖抑制篩選：觀察不同濃度化療藥物（如順鉑）對腫瘤細胞（如 A549）增殖的影響，計算 PDT 和分裂率，篩選最佳抑制濃度；

干細胞增殖分化研究：觀察間充質干細胞（MSC）在不同誘導條件下的增殖速率變化（如成骨誘導時增殖是否減慢），結合分化標志物熒光標記，關聯(lián)增殖與分化；

病毒感染對增殖的影響：觀察新冠病毒感染 Vero 細胞后，細胞增殖是否停滯（如計算感染后 24h、48h 的增殖倍數(shù)，與未感染組對比）。

綜上，培養(yǎng)箱內(nèi)時間序列熒光顯微觀察活細胞增殖，核心是 “穩(wěn)定環(huán)境 + 低毒標記 + 定量分析" 的結合。通過精準控制實驗條件和優(yōu)化數(shù)據(jù)分析，可客觀反映細胞增殖的動態(tài)規(guī)律，為細胞生物學研究、藥物篩選等提供可靠的動態(tài)觀測證據(jù)。